凝膠電泳
凝膠電泳（英語：Gel electrophoresis）或稱膠體電泳，是一種用於大分子（如DNA、RNA、蛋白質）以及其碎片的分離、分析技術。該技術被科學工作者用於分離具有不同物理性質（大小、電荷、等電點）的分子。凝膠電泳通常用於分析用途，但也可以作為預處理技術，在進行質譜、聚合酶連鎖反應、克隆、DNA定序或者免疫墨點等檢測之前，進行分子的純化。
凝膠電泳在用於分離核酸分子時，帶有負電荷的核酸分子在外加電場的作用下穿過凝膠組成的網格。由於較小的分子更容易通過網孔，較小的分子凝膠基質中穿行地更快，並且可以移動得更遠。這與分子篩的現象類似。[1]
在分離蛋白質分子時，蛋白質分子往往由於太大而不能穿過凝膠中的網孔，因此蛋白質的分離是依靠蛋白質分子上帶的電荷來進行的。
除了分離核酸和蛋白質等分子，凝膠電泳還可以用於分離納米微粒。
之所以選用凝膠而不是液體作為電泳的介質，有以下因素的考量：首先，外加電場可以引起液體的熱對流，在膠體中這種對流會被抑制；其次，有的凝膠可以起到一種分子篩的作用；凝膠還可以延緩分子穿越的速度，並且能在電泳後保持分離結果，為後續的染色提供機會。[2]
物理原理
[編輯]凝膠是固態的、多孔隙的交聯聚合物，是整個實驗進行的基質。大多數情況下，凝膠是由交聯的多聚物組成的。多聚物的組成和孔隙都會根據目標分子的性質來設計。
在分離蛋白質和在分離小核酸時凝膠通常由不同濃度的丙烯醯胺和交聯劑聚合而成；分離大一點的核酸時（長度超過幾百個鹼基），純化的洋菜更適合作為基質。
電泳是利用電場力移動凝膠基質中的分子的一種方法。將含有待測分子的樣本放入凝膠上的井（wells）中，並且施加電場，待測分子就會以不同的速率通過基質。
凝膠製備
[編輯]「凝膠電泳」的第一個部分「凝膠」，是指用來分離分子的受質（matrix）。大致上凝膠是個可以被科學家控制多孔性（porosity）的交聯聚合物。在分離蛋白質或小的核酸（DNA、RNA，或寡核苷酸）的時候，凝膠通常是用不同濃度的丙烯醯胺和一個交聯劑聚合而成，形成不同大小網眼的聚丙烯醯胺網狀系統。
分離較大的核酸（超過幾百個鹼基對時）較常用的受質是純化的洋菜膠，洋菜膠是海藻（seaweed）的萃取物。
在以上兩者裡的凝膠都是形成固體但是具孔隙的受質，外觀和觸感都像透明的果凍。不像聚丙烯醯胺產物，丙烯醯胺本身是種神經毒素，需要按良好藥品實驗研究規範（Good Laboratory Practices，GLP）操作以避免毒性，通常一般的實驗室都已經購買成品，生產方面只要交由生技工廠操作就可以。
電泳方法
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第二個部分，「電泳」，是指在凝膠（瓊脂糖凝膠 (Agarose)或十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳）上用來推動或拉住分子的電動勢（electromotive force, EMF）；將待測分子放進凝膠上的井（wells）並導入適當的電流，分子就會以不同的速率在有孔隙的膠體中移動；如果分子帶負電多就會往氧化極（anode），帶正電多就往還原極（cathode）移動（注意到膠凝電泳操作原理相似於電解池，氧化極帶正電而還原極帶負電）。在核酸（DNA或RNA）的例子裡，待測分子從負電極到正電極的移動方向是因為核酸骨架上的磷酸鹽攜帶負電。雙股DNA片段自然的形成長桿狀（long rods），所以核酸片段在凝膠內的移動和他們的旋轉半徑（radius of gyration）有關。簡單的說，就是和分子大小相關。單股DNA或RNA傾向於摺疊成複雜形狀的分子，根據他們的三級結構以複雜的方式在凝膠內移動。因此，像是氫氧化鈉或甲醯胺這類可以破壞氫鍵的化學物，就用來把DNA或RNA從三級結構變性，再度形成長桿狀。
另一方面，蛋白質有不同的電荷和複雜的形狀，所以當放電動勢（EMF）在同一種蛋白質樣品上，蛋白質可能會以不同的速度進入凝膠或完全不移動。所以蛋白質在有洗滌劑，如：十二烷基硫酸鈉(SDS)或十二烷基磷酸鈉(SDP)出現時會變性。洗滌劑會以負電荷覆蓋蛋白質。通常SDS鍵結的量跟蛋白質的大小有關係，所以鍵結後變質的蛋白質帶有負電荷，而且所有蛋白質有相似的「荷質比」（電荷和質量的比值）。因為變質的蛋白質移動方式像是長桿狀，而不是複雜的三級結構，和SDS結合的蛋白質在凝膠內移動的速率只和它的大小有關，跟它的帶電量或形狀無關。
在跑完電泳，最小的分子幾乎到達氧化極之後，可以對凝膠裡的分子染色，這樣才能看到分子。可以用溴化乙錠，銀或考馬斯亮藍染色。也可以用其他方法看到凝膠裡分離後的混合物組成。如果分析物的分子在紫外線下會發光，就可以在紫外線下拍出凝膠的照片。如果要分離的分子有放射性原子，凝膠可以用同位素示蹤劑記錄，記錄方法同上面所述。
如果一開始有很多個混合物一個接一個注入相鄰的「井」，跑出來的結果會是一條一條平行的軌跡〈lane〉。根據不同分子的數量，每一條軌跡都有一條或以上，明顯的亮帶（band），表示原本混合物分離出來的組成，每個亮帶代表一個組成，組成物分離不完全就會跑出重疊的亮帶，或者難以辨別的汙點（smear）就表示許多組成物沒有分解。
種類
[編輯]- 大的DNA或者RNA分子通常利用瓊脂糖凝膠電泳（agarose gel electrophoresis）分離，也可以使用聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE）。
- 蛋白質的凝膠電泳通常在加入十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳（英語：sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱SDS-PAGE）中進行，或者非變性凝膠電泳，或二維電泳。
- 毛細管電泳
- 酶譜法（zymography）
- 變性梯度膠凝電泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）
參見
[編輯]參考資料
[編輯]- ^ Sambrook J, Russel DW (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY.
- ^ Berg JM, Tymoczko JL Stryer L. Biochemistry 5th. WH Freeman. 2002. ISBN 0-7167-4955-6.
外部連結
[編輯]- Biotechniques Laboratory electrophoresis demonstration, from the University of Utah's Genetic Science Learning Center
- Protein electrophoresis and Western Blotting